Tóm tắt
Nghiên cứu này nhằm xác định đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và gen kháng kháng sinh ở bệnh nhân viêm phổi liên quan thở máy bằng giải trình tự metagenomic tại Bệnh viện đa khoa Đồng Nai. Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp dưới (dịch hút nội khí quản) sẽ được thu thập để nuôi cấy, định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ. Đồng thời, nghiên cứu ứng dụng giải trình tự metagenomic để phân tích hệ vi khuẩn và gen kháng kháng sinh có trong mẫu bệnh phẩm. Kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu vi khuẩn và gen kháng thuốc góp phần cải thiện chẩn đoán nhanh và chính xác, hỗ trợ lựa chọn kháng sinh phù hợp, góp phần giảm tỷ lệ tử vong và thời gian nằm viện của bệnh nhân
Quy trình thực hiện:
Chọn mẫu:
- Bệnh nhân trên 18 tuổi có triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng liên quan đến viêm phổi liên quan thở máy
- Tiêu chuẩn lựa chọn
Bệnh nhân thở máy ≥ 48 giờ, xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng/ xét nghiệm và tổn thương trên phim phổi, theo các tiêu chuẩn sau:
Các dấu hiệu lâm sàng và xét nghiệm:
+ Sốt > 38°C hoặc < 360C loại trừ các nguyên nhân khác
+ Tăng bạch cầu (≥ 12 x 109/L) hoặc giảm bạch cầu (≤ 4 x 109/L)
+ Thay đổi ý thức ở bệnh nhân cao tuổi (> 70 tuổi) loại trừ các nguyên nhân khác và ít nhất hai trong các dấu hiệu sau
Đờm mủ hoặc thay đổi tính chất đờm hoặc tăng tiết đờm hoặc tăng nhu cầu hút đờm
Ho hoặc ho tăng lên, hoặc khó thở hoặc thở nhanh
Khám phổi có ran
Tình trạng trao đổi khí xấu đi: giảm oxy máu (giảm độ bão hòa oxy máu, VD: PaO2/FiO2 ≤ 240), cần tăng nồng độ oxy khí thở vào (FiO2), hoặc cần thở máy và/hoặc tăng PEEP
Tổn thương trên phim phổi
Tổn thương mới xuất hiện hoặc tổn thương tiến triển trên phim phổi và không mất đi nhanh, có thể chụp X-quang phổi hoặc chụp cắt lớp vi tính phổi. Các dạng tổn thương trên phim phổi có thể gặp là: thâm nhiễm, đông đặc, tạo hang
Thu thập mẫu:
Dịch hút nội khí quản thu thập trong vòng 24 giờ sau chẩn đoán VAP. Mẫu được thu thập bằng cách hút qua ống nội khí quản bằng catheter. Mỗi bệnh nhân lấy chia thành 02 phần bằng nhau, bao gồm:
- 1 mẫu cho nuôi cấy, định danh và AST (kháng sinh đồ)
- 1 mẫu bảo quản ở -80°C cho metagenomic
Kỹ thuật thực hiện:
- Xử lý mẫu, tách chiết DNA mẫu ban đầu
- Nuôi cấy, định danh và làm kháng sinh đồ vi khuẩn
+ Nhuộm soi mẫu
+ Nuôi cấy mẫu trên môi trường Blood agar (BA), MacConkey (MC), Chocolate Agar with Haemoglobin and IsoVitaleX (CAHI). Cấy bằng phương pháp cấy định lượng
+ Phân tích kêt quả: bắt khuẩn lạc nghi ngờ, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa, và tính số lượng vi khuẩn (CFU/ml) = số khuẩn lạc x 103
+ Xác định vi khuẩn gây bệnh
+ Xác định giá trị MIC, phân loại chủng vi khuẩn nhạy/ kháng thuốc theo CLSI
+ Xác định nhóm vi khuẩn đa kháng và không đa kháng
+Thực hiện thử nghiệm vi pha loãng nhằm đánh giá tương quan giữa gen kháng kháng sinh với giá trị MIC
- Giải trình tự metagenomic
Mẫu được gửi giải trình tự metagenomic (16S rRNA sequencing (100 mẫu) và shotgun metagenomic (cho các mẫu vi khuẩn đa kháng, 40 mẫu)
- Phân tích dữ liệu metagenomic
+ Đánh giá chất lượng bằng FastQC
+ Xác định thành phần loài bằng nuôi cấy và metagenomic
Với 16sRNA sequencing: sử dụng QUIIME2
Với shotgun metagenomic: sử dụng Kraken2/MetaPLAN
+ Xác định gen kháng thuốc: CARD/NCBI (RGI, ABBricate)
+ Tính các chỉ số: alpha diversity, beta diversity, Abundance
- Xác định mối tương quan kiểu gen và kiểu hình
- Tổng hợp kết quả và viết luận án
