Tóm tắt
Ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến hàng thứ 5 thế giới theo thống kê của GLOBOCAN 2022, xếp thứ 4 trong các nguyên nhân tử vong do ung thư. Việt Nam thuộc nhóm các quốc gia có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày cao với hơn 16000 ca mắc mới mỗi năm [1]. Protein HtrA của Helicobacter pylori cắt đứt E-cadherin (protein then chốt duy trì sự liên kết giữa các tế bào biểu mô dạ dày) [2] cho phép vi khuẩn xâm lấn sâu hơn và tạo điều kiện cho hệ thống tiết loại 4 (T4SS) bơm độc tố CagA vào tế bào một cách hiệu quả hơn [3,4]. Sự kết hợp giữa các biến thể htrA độc lực cao với các kiểu gen cagA, vacA cụ thể có thể tạo ra một tổ hợp nguy cơ, thúc đẩy nhanh chóng quá trình hình thành các tổn thương tiền ung thư [4,5].
Mục tiêu nghiên cứu:
- Mô tả tính đa dạng di truyền gen htrA của Helicobacter pylori ở bệnh nhân tiền ung thư và ung thư dạ dày.
- Phân tích mối liên quan của đa hình gen htrA với các kiểu gen độc lực cagA, vacA.
- Đánh giá mối liên quan của đa hình gen htrA và các tổ hợp gen (htrA, cagA, vacA) với sự xuất hiện của các tổn thương tiền ung thư và ung thư dạ dày.
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vai trò của Helicobacter pylori trong tổn thương tiền ung thư và ung thư dạ dày
Khi xâm nhập vào niêm mạc dạ dày, H.pylori kích hoạt một chuỗi phản ứng viêm kéo dài dai dẳng bằng nhiều cách: tác động trực tiếp bằng enzyme urease, tiết các độc tố gây tổn thương niêm mạc dạ dày, kích hoạt phản ứng miễn dịch gây huy động các tế bào viêm thâm nhập vào lớp đệm của niêm mạc, thúc đẩy sự thay đổi cấu trúc mô học theo thời gian (chuỗi Cascade Correa: viêm mạn tính – viêm teo niêm mạc - dị sản ruột - loạn sản – ung thư biểu mô) [6].
2.2. Đặc điểm và chức năng của protein HtrA và gen htrA của vi khuẩn Helicobacter pylori
HtrA (High temperature Requirement A) hay còn gọi là Deg (periplasmic degradation protein) là một protein thiết yếu có tính bảo tồn cao, thuộc nhóm serine protease cảm ứng bởi sốc nhiệt liên kết với màng [7,8]. HtrA ở nội bào tham gia vào hệ thống kiểm soát chất lượng protein của vi khuẩn, đảm bảo các protein không thể tái gấp cuộn sẽ bị phân huỷ chọn lọc. HtrA ở ngoại bào trở thành một protease mạnh mẽ tấn công trực tiếp các protein của tế bào vật chủ. Protein mục tiêu của nó là các protein liên kết chặt và protein bám dính tế bào như E-cadherin. Bằng quá trình này, HtrA làm suy yếu và phá vỡ hàng rào biểu mô dạ dày, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập và giải phóng các yếu tố độc lực khác như cagA vào tế bào vật chủ một cách hiệu quả hơn [9].
Ngay cả HtrA bị cắt cụt vẫn duy trì được hoạt động protease và vẫn có thể phá huỷ mối nối bám dính trên E-cadherin, hoặc các mối nối chặt như claudin-8 và occluding. HtrA không những thúc đẩy quá trình xuyên màng biểu mô của H.pylori mà còn hỗ trợ khả năng giải phóng độc tố cagA vào tế bào vật chủ thông qua tương tác với thụ thể a5b1 integrin [10].
Nhìn chung, gần như tất cả các chủng H.pylori trên toàn thế giới đều mang gen htrA mã hoá cho protein HtrA, với tốc độ tiết HtrA tương đối đồng nhất là khoảng 9600 phân tử trên mỗi tế bào [11].
Năm 2015, Tegtmeyer và cs đã khảo sát trên 992 chủng H.pylori từ sáu nước thuộc các châu lục khác nhau, bao gồm Đức, Nhật Bản, Singapore, Hoa Kỳ, Mexico và Colombia cho thấy gene htrA, với kích thước đầy đủ là 1428 bp, hiện diện trong tất cả các chủng H.pylori nói trên. Đáng lưu ý, nghiên cứu của nhóm tác giả Tegtmeyer đã chứng minh được vai trò quan trọng của protein HtrA trong sự sống còn của vi khuẩn H.pylori. Vì vậy, HtrA có thể được xem là một mục tiêu mới đầy hứa hẹn cho liệu pháp tiệt trừ H.pylori [12].
Nghiên cứu của Lazar và cộng sự, năm 2024, đã báo cáo 100% chủng H.pylori nghiên cứu có mang gen htrA và đa hình gen htrA-171 có liên quan đến ung thư dạ dày cao hơn các đa hình khác. [13].
Năm 2023, Sharafutdinov và cộng sự đã khảo sát gen htrA của 1043 chủng H.pylori từ các bệnh nhân bệnh lý dạ dày tá tràng trên toàn cầu và phát hiện có 580 biến thể đơn nucleotide (single nucleotide variant – SNV), trong đó 149 biến thể dẫn đến hậu quả thay đổi amino acid, với hầu hết các biến thể là hiếm gặp. Phân tích của tác giả cho thấy có ba biến thể liên quan hậu quả lâm sàng, bao gồm: biến thể làm thay đổi amino acid 39 tại đầu N tận từ glutamic acid thành aspartic acid (39E/D), biến thể thay đổi amino acid 171 ở domain protease từ serine thành leucine (171S/L) và biến thể thay đổi amino acid 439 ở domain PDZ2 từ isoleucine thành valine (439 I/V). Trong đó, đáng lưu ý là biến thể 171 S/L, do tầm quan trọng về mặt chức năng của domain protease. Cụ thể, allele 171 L được gặp với tần suất cao hơn ở nhóm bệnh nhân ung thư [14].
Bảng. Các đột biến SNP trên gen htrA
Vị trí SNP
Tác động
Ký hiệu
Tham khảo
6
Phenylalanine ® Leucine
F6L
Yeh et al, 2019 [15]
25
Asparagine ® Serine
N25S
Yeh et al, 2019[15]
39
Acid aspartic/ Acid glutamic
E39
Backert et al, 2024[16]
68
Asparagine « Serine
S68N
Yeh et al, 2019[15]
171
Leucine « Serine
171L/S
Yeh et al, 2019 [15]
303
Valine « Isoleucine
V303I
Yeh et al, 2019 [15]
312
Valine « Alanine
A312V
Yeh et al, 2019[15]
382
Theonine « Valine/Alanine
T382A/V
Yeh et al, 2019[15]
439 (PDZ)
Valine/Isoleucine
L439
Backert et al, 2024[16]
2.3. Mối liên quan của đa hình gen htrA của Helicobacter pylori với gen cagA và vacA
Nghiên cứu của Imkamp và cộng sự năm 2019 về giải trình tự toàn bộ hệ gen của 41 phân lập H.pylori nhằm phát hiện các gen độc lực cagA, vacA, iceA và dupA cho thấy 19 chủng mang gen vacA (chiếm 46,3%). Trong số đó, 23 chủng (56%) mang alen vacA s1 (s1a hoặc s1b). Cụ thể 15/41 chủng (36,6%) mang alen vacA s1a (dưới dạng s1a/m1 và s1a/m2). Alen vacA s1b được phát hiện ỏ 8 chủng (5 s1b/m1, 3 s1b/m2), trong khi 18 chủng (43,9%) còn lại mang alen vacA s2/m2 [17].
Sự phối hợp giữa ba yếu tố htrA, cagA và vacA được coi là mô hình lý giải đầy đủ nhất cho độc lực biến thiên giữa các chủng H.pylori. Trong khi từng yếu tố riêng lẻ đều có vai trò quan trọng, các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ gây bệnh nghiêm trọng nhất xuất hiện khi cả ba độc lực này cùng tồn tại dưới dạng các kiểu gen độc lực mạnh là cagA dương tính kiểu Đông Á, vacA s1m1/i1 và htrA-171L [18].
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Helicobacter pylori được thu nhận từ mẫu mô dạ dày của bệnh nhân có tổn thương tiền ung thư và ung thư dạ dày được chẩn đoán và điều trị tại Bệnh viện Trường Đại học Y – Dược Huế và Bệnh viện Đại học Y Dược Buôn Ma Thuột.
3.2. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang
Công thức tính cỡ mẫu: 
Trong đó: α = 0,05, tương ứng Z1-α/2 = 1,96, chọn d = 0,1.
Trong nghiên cứu của tác giả Hoy B. và cộng sự [3] về các biến thể độc lực của htrA, tỉ lệ các chủng mang đa hình ảnh hưởng đến chức năng cắt E-cadherin ước tính khoảng 0,25, vì vậy chúng tôi lấy p = 0,25.
Tính được cỡ mẫu: n = 72,03. Như vậy, chúng tôi lấy ít nhất 73 bệnh nhân.
3.3. Phân tích và xử lý số liệu
Thống kê mô tả: sử dụng phần mềm spss 20
Phân tích gen, so sánh đa hình, xác định kiểu gen bằng các công cụ tin sinh học như PubMLST, MAFFT, SnapGen, MEGA, NnaSP…
Các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu y sinh học được bảo đảm trong quá trình thực hiện nghiên cứu:
+ Nghiên cứu phải được chấp thuận của hội đồng đạo đức trước khi triển khai.
+ Đối tượng tham gia nghiên cứu (ĐTNC), gia đình hoặc người giám hộ được cung cấp đầy đủ thông tin về nghiên cứu, mục tiêu nghiên cứu số lượng tham gia vào nghiên cứu, thời gian nghiên cứu, quyền lợi và rủi ro khi tham gia vào nghiên cứu.
+ Nếu bệnh nhân/gia đình/người giám hộ đồng ý tham gia nghiên cứu, bệnh nhân/gia đình/người giám hộ sẽ ký vào bản thoả thuận tham gia nghiên cứu. Một bản photo về thoả thuận tham gia nghiên cứu sẽ gửi cho bệnh nhân/gia đình/người giám hộ giữ.
+ Nếu bệnh nhân/gia đình/người giám hộ không đồng ý tham gia nghiên cứu, nghiên cứu viên không được đe dọa và gây khó khăn trong quá trình điều trị bệnh nhân. Bệnh nhân không tham giam nghiên cứu sẽ được sử dụng các dịch vụ thăm khám và điều trị theo thường quy của bệnh viện tương tự như bệnh nhân tham gia nghiên cứu.
+ Nếu bệnh nhân/gia đình/người giám hộ không biết chữ sẽ được nghe đọc phiếu chấp thuận nghiên cứu và được trả lời các câu hỏi với sự có mặt của người làm chứng. Người làm chứng sẽ khẳng định quy trình này bằng cách ký vào phiếu chấp thuận nghiên cứu.
+ Bệnh nhân/gia đình/người giám hộ đồng ý tham gia nghiên cứu một cách tự nguyện và có quyền rút lui bất cứ lúc nào.
+ Đối tượng tham gia nghiên cứu sẽ được miễn phí cho các xét nghiệm khác thuộc nội dung nghiên cứu.
+ Nguy cơ đối với sức khỏe của đối tượng tham gia nghiên cứu là không có vì nghiên cứu là sinh thiết và/hoặc vi khuẩn H.pylori là xét nghiệm thường quy và làm mô bệnh học để chẩn đoán bệnh là trong quy trình chẩn đoán và điều trị của bệnh nhân.
+ Chăm sóc đối tượng:
Trong quá trình tham gia nghiên cứu, các nghiên cứu viên thường xuyên thăm hỏi tình hình của ĐTNC và sẵn sàng trả lời bất kỳ thông tin hay thắc mắc nào của gia đình/người giám hộ liên quan đến nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu sẽ được được điều trị miễn phí trong trường hợp xảy ra các vấn đề sức khỏe do nghiên cứu gây ra.
+ Nghiên cứu đảm bảo nguyên tắc bảo mật và khuyết danh của đối tượng tham gia nghiên cứu bằng việc sử dụng mã số, bảo mật phiếu thông tin, phiếu hỏi và số liệu.
+ Kết quả xét nghiệm được báo lại cho bệnh viện, trường và hội đồng Y Đức.
+ Sau khi nghiên cứu kết thúc, bệnh nhân/gia đình/người giám hộ sẽ được thông báo (nếu muốn) về bất cứ phát hiện nào liên quan đến tình trạng sức khỏe của bệnh nhân.
+ Các mẫu được lấy từ đối tượng nghiên cứu sẽ được thực hiện các xét nghiện liên quan, được bảo quản theo quy trình thường quy của Bệnh viện và bệnh nhân/gia đình/người giám hộ có quyền quyết định tiếp tục lưu giữ hoặc hủy các mẫu đã thu thập.
- DỰ KIẾN KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Tính đa dạng di truyền của gen htrA ở các chủng Helicobacter pylori phân lập
Bảng: Tỷ lệ các đa hình gen ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn
Bảng: Tỷ lệ các đa hình gen ở các nhóm bệnh nhân
Bảng: Tỷ lệ các đa hình gen theo giới
4.2. Mối liên quan của đa hình gen htrA với các kiểu gen độc lực cagA, vacA
Bảng: Mối liên quan giữa đa hình gen htrA với kiểu gen độc lực cagA
Bảng: Mối liên quan giữa đa hình gen htrA với kiểu gen độc lực cagA trên nhóm bệnh nhân
Bảng: Mối liên quan giữa đa hình gen htrA với kiểu gen độc lực vacA
Bảng: Mối liên quan giữa đa hình gen htrA với kiểu gen độc lực vacA trên nhóm bệnh nhân
4.3. Mối liên quan của đa hình gen htrA và các tổ hợp gen (htrA, cagA, vacA) với sự xuất hiện của các tổn thương tiền ung thư dạ dày
Bảng: Mối liên quan của đa hình gen htrA và các tổ hợp gen với tổn thương tiền ung thư dạ dày
[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin 2021;71:209–49. https://doi.org/10.3322/caac.21660.
[2] Wessler S, Schneider G, Backert S. Bacterial serine protease HtrA as a promising new target for antimicrobial therapy? Cell Communication and Signaling 2017;15. https://doi.org/10.1186/s12964-017-0162-5.
[3] Hoy B, Löwer M, Weydig C, Carra G, Tegtmeyer N, Geppert T, et al. Helicobacter pylori HtrA is a new secreted virulence factor that cleaves E-cadherin to disrupt intercellular adhesion. EMBO Rep 2010;11:798–804. https://doi.org/10.1038/embor.2010.114.
[4] Harrer A, Boehm M, Backert S, Tegtmeyer N. Overexpression of serine protease HtrA enhances disruption of adherens junctions, paracellular transmigration and type IV secretion of CagA by Helicobacter pylori. Gut Pathog 2017;9. https://doi.org/10.1186/s13099-017-0189-6.
[5] Fiorani M, Tohumcu E, Del Vecchio LE, Porcari S, Cammarota G, Gasbarrini A, et al. The Influence of Helicobacter pylori on Human Gastric and Gut Microbiota. Antibiotics 2023;12. https://doi.org/10.3390/antibiotics12040765.
[6] Correa P. Human Gastric Carcinogenesis: A Multistep and Multifactorial Process- First American Cancer Society Award Lecture on Cancer Epidemiology and Prevention. Cancer Res 1992;52.
[7] Amieva MR, El-Omar EM. Host-Bacterial Interactions in Helicobacter pylori Infection. Gastroenterology 2008;134:306–23. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2007.11.009.
[8] Atherton JC, Blaser MJ. Coadaptation of Helicobacter pylori and humans: Ancient history, modern implications. Journal of Clinical Investigation 2009;119:2475–87. https://doi.org/10.1172/JCI38605.
[9] Schmidt TP, Perna AM, Fugmann T, Böhm M, Hiss J, Haller S, et al. Identification of E-cadherin signature motifs functioning as cleavage sites for Helicobacter pylori HtrA. Sci Rep 2016;6. https://doi.org/10.1038/srep23264.
[10] Zawilak-Pawlik A, Zarzecka U, Żyła-Uklejewicz D, Lach J, Strapagiel D, Tegtmeyer N, et al. Establishment of serine protease htrA mutants in Helicobacter pylori is associated with secA mutations. Sci Rep 2019;9. https://doi.org/10.1038/s41598-019-48030-6.
[11] Unemo M, Aspholm-Hurtig M, Ilver D, Bergström J, Borén T, Danielsson D, et al. The sialic acid binding SabA adhesin of Helicobacter pylori is essential for nonopsonic activation of human neutrophils. Journal of Biological Chemistry 2005;280:15390–7. https://doi.org/10.1074/jbc.M412725200.
[12] Tegtmeyer N, Moodley Y, Yamaoka Y, Pernitzsch SR, Schmidt V, Traverso FR, et al. Characterisation of worldwide Helicobacter pylori strains reveals genetic conservation and essentiality of serine protease HtrA. Mol Microbiol 2016;99:925–44. https://doi.org/10.1111/mmi.13276.
[13] Lazar D. An Up to Date on the Pathogenic Mechanisms, Diagnosis and Clinical Management, 2024.
[14] Sharafutdinov I, Tegtmeyer N, Linz B, Rohde M, Vieth M, Tay ACY, et al. A single-nucleotide polymorphism in Helicobacter pylori promotes gastric cancer development. Cell Host Microbe 2023;31:1345-1358.e6. https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.06.016.
[15] Yeh YC, Kuo HY, Chang WL, Yang HB, Lu CC, Cheng HC, et al. H. pylori isolates with amino acid sequence polymorphisms as presence of both HtrA-L171 & CagL-Y58/E59 increase the risk of gastric cancer. J Biomed Sci 2019;26. https://doi.org/10.1186/s12929-019-0498-9.
[16] Backert S, Tegtmeyer N, Horn AHC, Sticht H, Linz B. Two remarkable serine/leucine polymorphisms in Helicobacter pylori: functional importance for serine protease HtrA and adhesin BabA. Cell Communication and Signaling 2024;22. https://doi.org/10.1186/s12964-024-01635-5.
[17] Imkamp F, Lauener FN, Pohl D, Lehours P, Vale FF, Jehanne Q, et al. Rapid characterization of virulence determinants in helicobacter pylori isolated from non-atrophic gastritis patients by next-generation sequencing. J Clin Med 2019;8. https://doi.org/10.3390/jcm8071030.
[18] Backert S, Blaser MJ. The role of CagA in the gastric biology of helicobacter pylori. Cancer Res 2016;76:4028–31. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-16-1680.
